Londra'daki 'da görevli İskoç bakteriyolog , 3 Eylül 1928 tarihinde laboratuvarına döndüğünde temizlenmemiş bir deney kabında küf oluştuğunu fark etti. Kirlenmiş kabı atmak yerine inceleyen Fleming, küfün etrafındaki alanda bakterilerin gelişemediğini gözlemledi. Bu keşif, Penicillium cinsi mantarların bakterileri yok eden bir madde salgıladığını ortaya koydu. Fleming, bu maddeye "" adını vererek 1929 yılında bilimsel bir makaleyle bulgularını duyurdu.

Ancak saflaştırma ve kitlesel üretim zorlukları nedeniyle penisilin, ilk yıllarda tıp dünyasında geniş bir karşılık bulamadı. Yaklaşık 10 yıl sonra Oxford Üniversitesi'nden patolog ve biyokimyacı , Fleming'in çalışmalarını yeniden ele alarak maddeyi saflaştırmayı başardı. 1940 yılında fareler üzerinde yapılan deneylerde penisilin uygulanan deneklerin bakteriyel enfeksiyonlara karşı hayatta kaldığı belgelendi. Şubat 1941'de ise ağır stafilokok enfeksiyonu geçiren bir polis memuruna ilk insanlı deneme yapıldı. Hastada hızlı bir iyileşme gözlendi ancak stokların tükenmesi nedeniyle tedavi yarım kaldı.

1941 yılında ABD’ye giden araştırmacılar, Illinois'deki laboratuvarlarda daha yüksek verim sağlayan yeni bir Penicillium türü ve "derin tank fermantasyonu" yöntemini geliştirdi. Bu sanayi ölçekli üretim sayesinde penisilin, kitlesel bir tıbbi ürüne dönüştü. 1942 ve 1943 yıllarında II. Dünya Savaşı cephelerinde yaralı askerlerin tedavisinde yaygın olarak kullanılan ilaç, 1943 itibarıyla müttefik ordularının tüm ihtiyacını karşılayacak seviyeye ulaştı. Savaşın ardından 1946 yılında sivil pazarın erişimine açılan penisilin, birçok bakteriyel hastalığın tedavisinde standart yöntem haline geldi. Bu keşif ve geliştirme süreci, 1945 yılında Alexander Fleming, Howard Florey ve Ernst Chain'e Nobel Tıp Ödülü'nü kazandırdı.